CRISPR/Cas9技術(shù)高效制備山羊SOCS2基因編輯胚胎

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摘 要： 旨在設(shè)計(jì)、篩選高效編輯山羊胚胎生長負(fù)調(diào)控因子SOCS2基因的sgRNA，為通過SOCS2基因編輯創(chuàng)制快長型山羊奠定技術(shù)基礎(chǔ)。本研究利用在線網(wǎng)站對山羊SOCS2基因SH2結(jié)構(gòu)域保守序列設(shè)計(jì)2條sgRNA，構(gòu)建表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA及Cas9 mRNA；體外檢測sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率；在此基礎(chǔ)上將屠宰場山羊卵巢分離培養(yǎng)的442個(gè)孤雌胚胎進(jìn)行分組，2個(gè)試驗(yàn)組顯微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物，對照組注射超純水，以單個(gè)囊胚全基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增靶區(qū)域并測序鑒定，發(fā)生編輯的樣本進(jìn)行T-A克隆測序檢測編輯形式；根據(jù)在線網(wǎng)站預(yù)測，每條sgRNA選擇5個(gè)錯(cuò)配數(shù)最少的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行脫靶檢測。（剩余19693字）