利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備BLG基因敲除牛乳腺上皮細(xì)胞系

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摘 要： 旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建BLG基因敲除牛乳腺上皮細(xì)胞系（bovine mammary epithelial cells， bMECs），同時(shí)檢測BLG基因敲除后對(duì)細(xì)胞的影響。本研究利用體外切割試驗(yàn)篩選獲得靶向牛的BLG基因的第一外顯子序列的3條sgRNA，與CRISPR/Cas9表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染入 bMECs，利用濃度為1.8 μg·mL-1嘌呤霉素和6 μg·mL-1稻瘟菌素雙藥篩和PCR分析鑒定獲得BLG基因編輯的單克隆細(xì)胞株；利用Western blot（WB）驗(yàn)證細(xì)胞BLG表達(dá)；繪制生長曲線和CCK-8試驗(yàn)檢測BLG基因敲除對(duì)bMECs細(xì)胞增殖的影響；同時(shí)根據(jù)sgRNA序列，對(duì)基因組上潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR測序分析。（剩余18781字）