p53V149F 突變打靶載體及細(xì)胞模型的構(gòu)建

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摘要： 【目的】構(gòu)建p53 基因突變模型，為研究p53 基因突變引發(fā)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展提供細(xì)胞模型資源。【方法】利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，根據(jù) p53V149F 突變位點(diǎn)的序列，在線設(shè)計(jì)合成單鏈向?qū)gRNA，構(gòu)建CRISPR 打靶載體；將重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式分選陽(yáng)性細(xì)胞群，提取細(xì)胞基因組，Sanger 測(cè)序分析Cas9 核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)的切割情況，構(gòu)建同源修復(fù)模板，通過(guò)T7EN1 試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)編輯效率；將重組載體和同源模板通過(guò)電轉(zhuǎn)染方法共同轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞中，通過(guò)單克隆挑取、PCR 和Sanger 測(cè)序鑒定挑取含目標(biāo)突變的細(xì)胞株。（剩余11905字）